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TitleMaría Inmaculada González
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Table of Contents
                            Índice
Abreviaturas
I. Introducción
	I.1. La transmisión del impulso nervioso
	I.2. Transmisión glutamatérgica
		I.2.1. Diversidad molecular de los receptores de glutamato.
		I.2.2. Receptores de NMDA.
		I.2.3. Transportadores de glutamato de alta afinidad.
		I.2.4. Distribución de los transportadores de glutamato de alta afinidad.
		I.2.5. Regulación de GLT-1.
	I.3. El cliclo glutamato-glutamina
		I.3.1. Los transportadores de baja afinidad.
	I.4. Papel de las proteínas con dominios PDZ en la organización de la sinapsis
		I.4.1. Dominios PDZ.
		I.4.2. La proteína de anclaje PSD95.
	I.5. Regulación del tráfico de los transportadores de glutamato por ubiquitilación
		I.5.1. La ubiquitilación como modificación postraduccional.
		I.5.2. La ubiquitin ligasa Nedd 4.2.
		I.5.3. Ubiquitilación y tráfico de proteínas transmembrana.
II. Objetivos
III. Materiales y métodos.
	III.1. Cultivos celulares.
		III.1.1. Cultivos primarios de neuronas.
		III.1.2. Cultivo de células COS7 y MDCK.
		III.1.3. Transfección de células mediante lipofección.
	III.2. Anticuerpos.
		III.2.1. Producción y purificación de anticuerpos policlonales.
		III.2.2. Biotinilación del anticuerpo anti-GLT1b.
		III.2.3. Anticuerpos comerciales y cedidos
	III.3. Construcciones de cDNA.
	III.4. Determinación de la concentración proteica.
	III.5. Electroforesis e inmunodetección (Inmunotransferencia).
	III.6. Aislamiento de sinaptosomas.
	III.7. Preparación de P2/P3 de cerebro de rata.
	III.8. Ensayos de inmunoprecipitación en cultivos celulares.
	III.9. Ensayos de imnunoprecipitación en tejido.
	III.10. Tratamientos con activadores e inhibidores.
	III.11. Purificación de proteínas de fusión.
	III.12. Ensayo de pull down.
	III.13. Purificación de la proteína 6X HIS-TAG.
	III.14. Detección de las interacciones de GLT1b con dominios PDZ.
	III.15. Análisis de la matriz de anticuerpos.
	III.16. Técnicas de imnunofluorescencia en células cultivadas.
	III.17. Técnicas de inmunohistoquímica.
	III.18. Técnicas de microscopía óptica y confocal.
	III.19. Técnicas de microscopía electrónica.
	III.20. Ensayo de β-galactosidasa.
	III.21. Ensayo de transporte de glutamato en células COS7.
	III.22. Ensayo de marcaje de superficie celular con reactivos unidos a biotina.
	III.23. Internación del transportador mediante marcaje de superficie con biotina.
	III.24. Procesamiento de los datos y análisis densitométrico.
	III.25. Experimentos de marcaje metabólico (Pulso y caza).
	III.26. Herramientas bioinformáticas.
	III.27. RT-PCR y PCR cuantitativa.
	III.28. RNA de interferencia.
IV. Resultados
	I Parte: Estudio sobre la distribución de los transportadores de glutamina y glutamato en el SNC
		IV.1. Producción de anticuerpos policlonales contra algunos transportadores de las sinapsis glutamatérgicas.
			IV.1.1. Caracterización de anticuerpos policlonales.
				IV.1.1.1. Anticuerpos anti-GLT1b.
				IV.1.1.2. Anticuerpos anti-SNAT5.
				IV.1.1.3. Anticuerpos anti-SNAT2.
		IV.2. Estudio de la distribución de los miembros de la familia SNAT en cerebro de rata
			IV.2.1. Distribución de SNAT5
				IV.2.1.1. Distribución regional de SNAT5 en el cerebro mediante inmunoquímica.
				IV.2.1.2. Distribución de SNAT5 mediante microscopía óptica de baja resolución.
				IV.2.1.3. Comparación de los patrones de distribución de SNAT5 y vGLUT1.
				IV.2.1.4. Localización de SNAT5 en astrocitos por microscopía óptica de alta resolución.
				IV.2.1.5. Análisis ultraestructural de la distribución de SNAT5.
			IV.2.2. Distribución de SNAT2 (ATA2)
				IV.2.2.1. Distribución regional de SNAT2 en tejidos mediante inmunoquímica.
				IV.2.2.2. Distribución regional de SNAT2 por microscopía de baja resolución.
				IV.2.2.3. Distribución celular y subcelular de SNAT2 por microscopía óptica de alta resolución.
				IV.2.2.4. Análisis ultraestructural de la distribución de SNAT2.
	II Parte: Estudios sobre la localización y el tráfico del transportador de glutamato GLT1
		IV.3. Anclaje de GLT1b en la membrana plasmática
			IV.3.1. Búsqueda de proteínas que interaccionan con GLT1b.
			IV.3.2. GLT1b interacciona con PSD95.
			IV.3.3. Caracterización de la interacción entre PSD95 y GLT1.
			IV.3.4. Determinación de los dominios PDZ de PSD95 que intervienen en la interacción con GLT1b.
			IV.3.5. PSD95 forma un puente entre GLT1b y NMDAr.
			IV.3.6. PSD95 incrementa la actividad de transporte de GLT1b.
			IV.3.7. PDS95 promueve el aumento de la densidad de transportador en la membrana plasmática.
			IV.3.8. La coexpresión con PSD95 no altera la inserción de GLT1b en la membrana.
			IV.3.9. La coexpresión con PSD95 inhibe la endocitosis de GLT1b.
			IV.3.10. Interacción de GLT1b y PSD95 en cultivos primarios: La localización específica de GLT1b en cultivos primarios no depende del ETCI terminal.
			IV.3.11. GLT1b y PSD95 colocalizan en cultivos primarios.
			IV.3.12. GLT1b se expresa en dendritas y en astrocitos del cerebro de rata
		IV.4. Formación de heteroligómeros entre GLT1a y GLT1b
			IV.4.1. GLT1a también interacciona con PSD95 y NMDAR.
			IV.4.2. GLT1a y GLT1b forman heteroligómeros.
			VI.4.3. GLT1a requiere a GLT1b para interaccionar con PSD95.
			IV.4.4. Colocalización de GLT1a, GLT1b y PSD95 en cultivos primarios.
	III Parte: Regulación del tráfico de GLT1a por ubiquitilación
		VI.5.1. Degradación lisosomal vs proteasomal.
		IV.5.2. Implicación del proteasoma en la biosíntesis de GLT1a.
		IV.5.3. GLT1a se ubiquitila en sistemas de expresión heterólogos
		IV.5.4. GLT1a se ubiquitina en cerebro
		IV.5.5. El efecto de TPA sobre la ubiquilación de GLT1 se debe a la activación de PKC.
		IV.5.6. GLT1 se ubiquitila en la membrana plasmática.
		IV.5.7. El bloqueo de la endocitosis promueve la acumulación de GLT1a ubiquitilado en la membrana plasmática.
		IV.5.8. La eliminación de las lisinas de la cola C-terminal de GLT1a bloquea la endocitosis promovida por TPA
		IV.5.9. La activación de PKC promueve la endocitosis pero no la degradación de GLT1a.
		IV.5.10. La ubiquitin ligasa Nedd4-2 podría participar en la ubiquilación de GLT1a.
		IV.5.11. La coexpresión de Nedd4-2 incrementa la ubiquitilación y degradación de GLT1a.
		IV.5.12. Nedd4-2 interacciona con GLT1.
		IV.5.13. El silenciamiento de Nedd4-2 mediante RNAi disminuye la ubiquitilación de GLT1a y su degradación.
		IV.5.14. La eliminación de las lisinas de los extremos N y C-terminal de GLT1a bloquea la degradación promovida por Nedd4.2
V. Discusión
	V.1. Localización de miembros de la familia SNAT.
	V.2. Localización e interacciones de GLT1b.
	V.3. Interacción con PSD-95.
	V.4. Formación de heteroligómeros.
	V.5. Tráfico y ubiquitilación de GLT1a.
VI. Conclusiones
VII. Resumen
VIII. Bibliografía
IX. Anexo
                        

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