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Table of Contents
                            Agradecimientos
Índice General
Resumen
Summary
Objetivos y Plan de trabajo
1. Introducción
	1.1. El vino.
	1.2. Elaboración del vino.
		1.2.1. Vinificación en blanco.
			1.2.1.1. Recepción, despalillado y estrujado de la uva.
			1.2.1.2. Prensado y desfangado.
			1.2.1.3. Encubado y fermentación alcohólica.
			1.2.1.4. Trasiego, clarificación y estabilización.
		1.2.2. Vinificación en tinto.
			1.2.2.1. Recepción, despalillado y estrujado de la uva.
			1.2.2.2. Maceración con orujos y fermentación alcohólica (Encubado).
			1.2.2.3. Descube, prensado y final de la fermentación.
			1.2.2.4. Fermentación maloláctica.
				1.2.2.4.a. Algunos aspectos positivos de la fermentación maloláctica.
				1.2.2.4.b. Algunos aspectos negativos de la fermentación maloláctica.
			1.2.2.5. Trasiego, clarificación y estabilización.
			1.2.2.6. Envejecimiento del vino.
		1.2.3. Elaboración de vinos espumosos.
			1.2.3.1. Tiraje.
			1.2.3.2. Rima.
			1.2.3.3. Punta.
			1.2.3.4. Degüelle.
	1.3. La fracción nitrogenada del vino.
		1.3.1. Aminoácidos libres.
			1.3.1.1. Evolución de los aminoácidos libres durante la fermentación alcohólica.
			1.3.1.2. Evolución de los aminoácidos libres en el vino durante la fermentación maloláctica.
			1.3.1.3. Evolución de los aminoácidos libres en vinos espumosos y vinos envejecidos sobre lías.
		1.3.2. Aminas biógenas.
		1.3.3. Péptidos.
			1.3.3.1. Análisis, aislamiento y caracterización de los péptidos.
			1.3.3.2. Evolución de los péptidos en el vino durante la fermentación alcohólica.
			1.3.3.3. Evolución de los péptidos en el vino durante la fermentación maloláctica.
			1.3.3.4. Evolución de los péptidos en los vinos espumosos y en los vinos envejecidos sobre lías.
		1.3.4. Proteínas.
	1.4. Propiedades de los péptidos.
		1.4.1. Propiedades físico-químicas.
		1.4.2. Propiedades sensoriales.
		1.4.3. Propiedades funcionales.
			1.4.3.1. Actividad antimicrobiana.
			1.4.3.2. Actividad antioxidante.
			1.4.3.3. Actividad antihipertensiva.
	1.5. Cromatografía de líquidos de alta temperatura.
		1.5.1. Antecedentes.
		1.5.2. Ventajas de la HTLC sobre la HPLC convencional.
		1.5.3. Comportamiento de la fase móvil en HTLC.
		1.5.4. Modificaciones de un equipo de HPLC para operar a altas temperaturas.
		1.5.5. Aspectos a controlar debidos a la temperatura.
		1.5.6. Columnas de cromatografía de líquidos de alta temperatura.
		1.5.7. Bioensayos acoplados a la HTLC.
2. Materiales y Métodos
	2.1. Muestras.
		2.1.1. Vino tinto de la variedad Tempranillo.
		2.1.2. Vinos espumosos de las variedades Malvar y Albillo.
		2.1.3. Vinos comerciales.
		2.1.4. Autolisado de levaduras.
	2.2. Determinaciones Cuantitativas.
		2.2.1. Cuantificación del nitrógeno total.
		2.2.2. Cuantificación del nitrógeno de compuestos nitrogenados de alto peso molecular.
		2.2.3. Cuantificación del nitrógeno de los aminoácidos libres.
		2.2.4. Cuantificación del nitrógeno de los aminoácidos libres más péptidos.
		2.2.5. Cuantificación del nitrógeno de péptidos.
			2.2.5.1. Estudio de la fracción nitrogenada.
			2.2.5.2. Estudio de la bioactividad.
		2.2.6. Análisis de aminoácidos libres por cromatografía de líquidos de alta eficacia.
		2.2.7. Análisis de aminoácidos totales por cromatografía de líquidos de alta eficacia.
		2.2.8. Análisis de aminas biógenas por cromatografía de líquidos de alta eficacia.
	2.3. Aislamiento y caracterización de la fracción peptídica.
		2.3.1. Concentración de la muestra.
		2.3.2. Fraccionamiento del concentrado por cromatografía de líquidos en columna abierta (Sephadex LH-20). Obtención de la fracción de peso molecular menor de 4000 Da.
		2.3.3. Fraccionamiento de la fracción menor de 4000 Da por cromatografía de líquidos en columna abierta (Cosmosil 140 C18-OPN).
		2.3.4. Fraccionamiento por cromatografía de líquidos de alta eficacia semipreparativa en fase inversa.
		2.3.5. Análisis de péptidos por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC).
	2.4. Análisis de monosacáridos constituyentes de polisacáridos por cromatografía de gases.
	2.5. Análisis Estadísticos.
	2.6. Esquema del fraccionamiento de los vinos para el estudio de la fracción peptídica.
	2.7. Evaluación de las bioactividades de las muestras estudiadas.
		2.7.1. Determinación de la actividad inhibitoria de la Enzima Convertidora de Angiotensina (IECA).
		2.7.2. Determinación de la actividad antioxidante.
	2.8. Cromatografía de líquidos de alta temperatura.
		2.8.1. Sistema cromatográfico de cromatografía líquida de alta temperatura.
		2.8.2. Empaquetamiento de columnas.
		2.8.3. Optimización del método de separación mediante HTLC.
		2.8.4. Ensayo Bioquímico de la Catepsina B.
			2.8.4.1. Sistema HTLC.
			2.8.4.2. Ensayo bioquímico en línea.
		2.8.5. Ensayo Bioquímico de la ECA.
			2.8.5.1. Sistema HTLC.
			2.8.5.2. Ensayo bioquímico en línea.
		2.8.6. Ensayo de bioactividad en un autolisado de levadura vínica mediante HTLC-MS modificado.
			2.8.6.1. Preparación de autolisado de levadura.
			2.8.6.2. Detección en línea.
3. Resultados
	3.1. La fracción nitrogenada de vinos tintos envejecidos con y sin lías.
		3.1.1. Influencia de la fermentación maloláctica, de los tratamientos postfermentativos y del envejecimiento con y sin lías, sobre los compuestos nitrogenados de vinos tintos.
			3.1.1.1. Variación del nitrógeno total, de los aminoácidos libres y de las aminas biógenas durante la fermentación maloláctica e influencia de los tratamientos de clarificación y estabilización.
			3.1.1.2. Variación del nitrógeno total, de los aminoácidos libres y de las aminas biógenas durante el envejecimiento en barrica con o sin lías.
			3.1.1.3. Variación de la fracción peptídica del vino durante la fermentación maloláctica e influencia del envejecimiento con y sin lías.
				3.1.1.3.a. Fraccionamiento de los péptidos.
				3.1.1.3.b. Evolución y composición de los péptidos más polares.
				3.1.1.3.c. Evolución y composición de los péptidos menos polares.
				3.1.1.3.d. Composición en monosacáridos de los polisacáridos de las fracciones peptídicas.
			3.1.1.4. Resumen de los principales resultados obtenidos del estudio de la fracción nitrogenada de los vinos tintos.
	3.2. La fracción nitrogenada de vinos espumosos.
		3.2.1. Influencia de la variedad de uva, de la segunda fermentación, de la cepa de levadura y del envejecimiento con las levaduras sobre los compuestos nitrogenados de vinos espumosos elaborados por el método tradicional.
			3.2.1.1. Variación del nitrógeno total, del nitrógeno de alto peso molecular y de los aminoácidos libres.
			3.2.1.2. Variación de la fracción peptídica durante la segunda fermentación y el envejecimiento con las levaduras.
				3.2.1.2.a. Fraccionamiento de los péptidos.
				3.2.1.2.b. Evolución y composición de los péptidos más polares.
				3.2.1.2.c. Evolución y composición de los péptidos menos polares.
				3.2.1.2.d. Composición en monosacáridos de los polisacáridos de las fracciones peptídicas.
			3.2.1.3. Resumen de los principales resultados obtenidos del estudio de la fracción nitrogenada de vinos espumosos.
	3.3. Bioactividad de los péptidos del vino.
		3.3.1. Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina en vinos comerciales.
		3.3.2. Caracterización de las fracciones con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina en vinos tintos. Influencia de la fermentación maloláctica y del envejecimiento en barrica con lías.
			3.3.2.1. Actividad inhibitoria de la ECA de las muestras completas.
			3.3.2.2. Actividad inhibitoria de la ECA de las fracciones obtenidas por cromatografía de líquidos en una columna abierta de Cosmosil 140 C18-OPN.
			3.3.2.3. Fraccionamiento de las fracciones obtenidas del Cosmosil 140 C18-OPN por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa semipreparativa. Estudio de dichas fracciones.
		3.3.3. Caracterización de las fracciones con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina en vinos espumosos. Influencia de la segunda fermentación y del envejecimiento con las levaduras.
			3.3.3.1. Actividad inhibitoria de la ECA de las muestras completas.
			3.3.3.2. Actividad inhibitoria de la ECA de las fracciones obtenidas por cromatografía de líquidos en una columna abierta de Cosmosil 140 C18-OPN.
			3.3.3.3. Fraccionamiento de las fracciones obtenidas del Cosmosil 140 C18-OPN por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa semipreparativa. Estudio de dichas fracciones.
		3.3.4. Bioactividad en un autolisado de levaduras en un medio vínico modelo.
			3.3.4.1. Evolucion de los compuestos nitrogenados liberados por una cepa de S. cerevisiae bajo autolisis acelerada.
			3.3.4.2. Fraccionamiento de los péptidos presentes en el autolisado de levaduras.
			3.3.4.3. Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina del autolisado de levaduras.
			3.3.4.4. Actividad antioxidante del autolisado de levaduras
		3.3.5. Resumen de los principales resultados obtenidos del estudio de la bioactividad de los péptidos del vino.
	3.4. Desarrollo de un método de cromatografía de líquidos de alta temperatura para el estudio on-line de compuestos bioactivos.
		3.4.1. Optimización del método de separación mediante HTLC.
			3.4.1.1. Composición de la fase móvil.
			3.4.1.2. Estabilidad térmica del relleno de la columna.
			3.4.1.3. Temperatura de la columna.
				3.4.1.3.a. Influencia de la temperatura sobre la retención cromatográfica.
				3.4.1.3.b. Influencia de la temperatura sobre la concentración de disolvente orgánico.
			3.4.1.4. Velocidad del flujo de la fase móvil.
		3.4.2. Estudio de la bioactividad mediante acoplamiento de HTLC con ESI-MS en flujo continuo.
			3.4.2.1. Estudio de la bioactividad de la catepsina B mediante acoplamiento de HTLC con ESI-MS en flujo continuo.
				3.4.2.1.a. Estudio de la influencia del gradiente de temperatura sobre el ensayo de la bioactividad, de la catepsina B, en continuo.
				3.4.2.1.b. Sensibilidad del sistema en el ensayo bioquímico con catepsina B.
			3.4.2.2. Estudio de la bioactividad de la ECA mediante acoplamiento de HTLC con ESI-MS en flujo continuo.
			3.4.2.3. Ensayo de bioactividad de inhibidores de la ECA en un autolisado de levadura vínica.
		3.4.3. Resumen de los principales resultados obtenidos del desarrollo de un método de cromatografía de líquidos de alta temperatura para el estudio on-line de compuestos bioactivos.
4. Conclusiones
5. Bibliografía
                        

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